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相差显微镜关键的四步使用方法

第一步:光源的选择
    相差显微镜观察的光源要满足三个最基本条件:第一,为较强的光源。因为在相差显微镜中环状光阑限制了相当数量的光能进入成像光路。位相板还要吸收掉直射光的60~90%。库列照明方法是满足这一条件的最有效措施。第二,必须吸收掉光源的热辐射线。因为相差显微镜下观察的对象中主要是生活状态下的活细胞。在光路上设置除热滤光片或吸热水层可以满足去热条件。第三,单色光光源能够保证正确调整生物标本的折射率差异。在光源前附加绿色滤光片足以解决这一条件。
    库列照明方法(参照图1)的第一步,要放置标本,调好焦距。其次确定光源的位置。使用传统显微镜时,要把照明灯放置在适当的距离上,使光源会聚镜的焦面对在孔径光阑的平面上。具体操作是:在孔径光阑上放置磨砂破片。当照明灯的位置适当时,在磨砂玻片上看到灯丝的影像。当使用内装光源的显微镜时,灯光的距离只能用会聚镜的位置加以调整。
    其次调整孔径光阑的孔径。为此目的,首先缩小孔径光阑,其次拔掉目镜,利用对焦望远目镜逐渐开大孔径光阑,使其边缘适与物镜口径相对应。
这两步操作完成后即可使用显微镑。库列照明法的最重要优点是照明光线充足均匀,并消除散射光的干扰。
第二部:标本
    相差显微镜观察的标本基本上是未染色生物标本,或生活状态下的生物标本。观察这类标本时培养瓶壁、载玻片、盖玻片等一切插入光路的物体的厚薄要均匀,介面要平整,否则致使光路畸变,抵消标本细节的位相差即光程差。
第三部:校对光栏和相板的共轭面
    相差显微镜的使用方法中最关键性操作就是使环状光阑的亮环与位相板的共轭面(暗环)相对准。绝不能相互偏离,也不能大小不一。如果校对不准确.要泄漏直射光,破坏相差效果。
    为了校对共轭面,首先作到光源照明正确,放置标本,调好物镜焦距,而后拔掉目镜,换插校正望远月镜。将望远目镜的接目透镜简(内层管)向外抽出。抽到能看清环状光阑的亮环和位相板的暗环为止。用固定螺旋把接目镜镜筒固定在此位置上,边观察边调推共轭面。
    如果看到图2所示环状光阑的亮环大于位相板的暗环,或像B所示前者小于后者时,要用聚光镜的升降来调整大小。当看到D所示二者偏移时,用环状光阑合轴调节螺旋调到光路中心。一旦出现C所示的情况,即视野半边亮另半边暗时,调光源光轴。共轭面的正确调整以图E为准。有时出现多层亮环、暗环、圈套圈的情景。这就考虑环状光阑是否处于聚光镜的前焦面上,光源的距离是否合适等问题。校准之后拔掉校正望远目镜,安放原来的目镜,进行观察。
第四步:正确选用位相板
    有些文献中往往用缩写代表某种位相板。例如PM全文是positive meium,即暗反差(正反差)吸光率中度位相板。NH的全文是negative high,即明反差(负反差)吸光率高。DL代表dark low,暗反差低吸收率,BM代表bright medium,明反差中度吸收率。
    位相差观察时在什么样条件下应该用什么种类的位相板问题,无法作出定论。因为标本的各种细节的折射率各不相同。情况变化复杂,无法固定一些条件。但是大体上可以说标本细节与介质问反差显著时,可用低吸收率位相板,而反差小时,用高吸收率位相板。物体形体大时用低相板,而物体过小时用高相板。

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