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生物显微镜-活细胞观察的应用

   活细胞观察一直是困扰科研人员的一个难题,20世纪30年代,荷兰物理学家Zernike设计的相差生物显微镜利用光的衍射和干涉特性,把透过标本不同区域的光波的光程转变成振幅差,使细胞内各种结构之间呈清晰可见的明暗对比,从而成功地解决了生物学上的难题。自从有了生物显微镜,活细胞观察也变得异常简单。通常采用相差法直接观察,也可以用暗视野来实现。奥林巴斯显微镜IX51、IX71无疑是相差观察的首选。

    相差生物显微镜由相差聚光器和相差物镜两个主要部分组成。它与普通光镜相比多了两个部件,一个是在聚光器上增加一个环形光阑,使透光聚光器的光性形成空心光锥、聚焦到标本上。另一个是在物镜的后焦面增加一个相板,相板有一个环形区,其大小适好通过环形光阑的直射光,相板各区渡以不同物质,使得通过环形区的光比通过相板其他部位的光超前或滞后1/4波长。
    相差生物显微镜的基本原理:把透过标本的可见光的光程差变成振幅差,从而提供了各种结构之间的对比度,使标本的各种结构变得更清晰可见。光性透过标本后,发生折射,偏离了未通过标本的的光性的光路,这两租光性和轴后,则发生相互干涉现象。透过生物标本发生折射的光性与未透过标本的光性之间产生了光程差。前者被阻滞了1/4波长。如果把光程差再增加了1/4波长,则变为1/2波长,和轴后两束光线的干涉加强,使标本周围发生晕圈,提高了可见度。
    用相差生物显微镜可观察活细胞,并可在镜下连续拍摄记录体外培养细胞的活动,如细胞分裂、细胞迁移运动等过程。用奥林巴斯显微镜IX系列观察活细胞的步骤如下:
    1)调整好相差生物显微镜:
    首先调好相位板使聚光器相位板号与接物镜方法倍数相一致。然后抽出目镜,再换辅助镜,移动辅助镜筒并调整聚光器相位板,使视影中两个大小一样的光环相互吻合。再从新换上原接目镜,即成相差图像。当更换不同倍数接物镜时,需按上述过程重新调节。
    2)观察培养瓶(皿)准备:
    生物显微镜培养瓶(皿)要平坦,质地均匀,透光性好,在观察前将培养瓶(皿)面擦净,勿流任何残留污迹。
    3)调光:
    主要调整照明光的照明度和光轴,令视野照明均匀。首先用低倍物镜,并把照明灯虹彩光调至最小,使光落于视野中央;如有偏斜可用聚光器的调整螺丝进行调整。然后打开虹彩光使视野内呈均匀照明强度,并使目的物图像达到最大限度反差为止。
    4)调焦与摄影:
    奥林巴斯显微镜IX51视野中间都有双线十字,调焦前先转动目镜使十字的双线清晰,然后再用调焦旋钮调节物镜,使观察物体清晰。在照相目镜上也要采用同样步骤调焦。摄影目镜与观察目镜焦点不一致时,也要根据需要调焦,一般照相时以摄影目镜为主,观察时以观察目镜为主。照相时应做好记录,把细胞种类、代数、观察内容、放大倍数、时间等一一记录下来,以备日后检查和对比。
    5)细胞观察:
    生长在瓶底上的细胞悬液最适宜用奥林巴斯显微镜IX倒置系列观察,而且需附有长焦距聚光器,才能观察厚度较大的培养瓶(皿)。若用油镜观察细胞微细结构,需用支持物培养法,把细胞培养在长形盖片上,观察时从瓶中取出制成临时标本。方法为:取一大型载物片,再取一块优质滤纸剪成长方窗形,置于载物片上,用吸管向纸框中滴数滴培养基,充满框内空间和浸湿纸框;把生长有细胞的盖片含细胞面向上放在纸框中,再辅以大盖片。观察时应不断从标本侧面滴加加适量营养液,以防不断蒸发。此法只限于短时间观察细胞之用。

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